ANYONiK-YUZEY-AKTiF-MADDELERiN-BiYOLOJiK-PARCALANABiLiRLiK-ORANININ-TAYiNi.htmUZEY AKTiF MADDELERiN BiYOLOJiK PARCALANABiLiRLiK ORANININ TAYiNi

EK-1

ANYONİK YÜZEY AKTİF MADDELERİN BİYOLOJİK PARÇALANABİLİRLİK ORANININ TAYİNİ

Referans metod

BÖLÜM 1

1.1. Tanım

Bu metodda  “anyonik yüzey aktif maddeler” teriminden,  katyonik ve anyonik iyon değiştiricilerden geçirildikten sonra, kademeli elüsyon tekniği ile ayrılan ve Bölüm 3’te verilen analitik işleme göre metilen mavisi aktif madde (MBAS) olarak tayin edilen maddeler anlaşılır.

1.2. Ölçmeler için gereken deney donanımı

Ölçme işleminde, genel hatları Şekil 1’de ve ayrıntıları Şekil 2’de verilen deney donanımı (küçük bir aktif çamur tesisi) kullanılır. Donanım, aşağıda belirtilen kısımlardan oluşur:

-          Sentetik pis su deposu A: Sentetik pis suyu depolamak için, 

-          Besleme ayar pompası B,

-          Havalandırma kabı C,

-          Çöktürme kabı D,

-          Hava pompası E: Aktif çamurun C kabına tekrar tekrar beslenmesini sağlamak için,

-          Kap F: İşlemden geçirilmiş suyu depolamak için.

A ve F kapları camdan veya uygun bir plastikten yapılmış olmalı ve en az 24 litrelik bir hacme sahip olmalıdır. B pompası, sentetik pis suyu, havalandırma kabına sabit bir debide gönderebilmelidir. Bu kap, normal işletim esnasında, üç litre sıvı karışım ihtiva eder. C kabının koni şeklindeki taban kısmının üst bölgesinde asılı halde gözenekli (sinterlenmiş) bir G havalandırma küpü bulunur. Havalandırıcıdan geçirilen hava miktarı, H debi ölçeriyle sürekli izlenmelidir.

1.3. Sentetik pis su

Deneyde, sentetik olarak hazırlanmış pis su kullanılır. Bu amaçla, her bir litre çeşme suyunda, aşağıda belirtilen maddelerden karşılarında belirtilen  miktarlarda madde çözülmüş olacak şekilde, deneylere yetecek miktarda pis su çözeltisi hazırlanır.

MBAS, deneye tabi tutulacak üründen, Bölüm 2’de verilen metoda göre ekstrakte edilir.

Sentetik pis su, kullanılacağı gün hazırlanmalıdır.

1.4. Numunelerin hazırlanması

1.4.1. Tek tip (başka maddeler katılmamış) yüzey aktif maddeler, olduğu haliyle deneye tabi tutulabilir. Sentetik pis su (Madde 1.3) hazırlanabilmesi için, numunenin MBAS muhtevasının bilinmesi gereklidir.

1.4.2. Formüle edilmiş ürünler, MBAS ve sabun muhtevası açısından analize tabi tutulmalıdır. Bu tür ürünler, alkolle ekstrakte edilmeli ve  MBAS muhtevası ayrılmalıdır (Bkz. Bölüm 2). Sentetik pis suyun hazırlanabilmesi için MBAS muhtevasının bilinmesi gereklidir.

1.5. Deney donanımının çalıştırılması

İlk olarak, C havalandırma kabı ve D çöktürme kabı sentetik pis su ile doldurulur. D kabının yüksekliği, C havalandırma kabının hacmi üç litre olacak şekilde sabitlenir. Esas itibariyle evsel kaynaklı pis suların işlendiği bir pis su arıtma tesisinden yeni alınmış, iyi kalitede 3 mL’lik ikinci kademe sıvı atığı sentetik pis suya ilave edilerek aşılama yapılır. Bu aşılama sıvısı, numune alma ve uygulama işlemleri arasında aerobik şartlarda (havalandırılarak) muhafaza edilmelidir. aşılamadan sonra, G havalandırıcısı, E hava pompası ve B besleme ayar pompası çalıştırılır. Sentetik pis su, besleme debisi 1 litre/saat olacak şekilde, C havalandırma kabından geçirilir. Bu şekilde, pis suyun C kabındaki ortalama alıkonma süresi üç saate ayarlanmış olur. Havalandırma hızı, C kabındaki karışım sürekli süspansiyon halinde kalacak ve çözünmüş oksijen muhtevası en az 2 mg/L olacak şekilde ayarlanır. Bu esnada, uygun yollarla köpüklenme önlenmelidir. Aktif çamuru inhibe eden veya MBAS içeren köpük önleyici maddeler kullanılmamalıdır. E hava pompası, çöktürme kabındaki aktif çamur, C havalandırma kabına sürekli ve düzenli olarak  tekrar beslenecek şekilde ayarlanır. C havalandırma kabının üst kısmında, D çöktürme kabının tabanında veya dolaşım hattında birikmiş çamur, fırça veya başka uygun bir metod ile, günde en az bir defa kazınarak dolaşıma verilmelidir. Çamurda çökelme durduğunda, 2 mL’lik bölümler halinde % 5’lik demir (III) klorür çözeltisi ilave edilerek yoğunluğu arttırılabilir. Gerektiğinde, bu işlem tekrar edilir.

D çöktürme kabından taşan sıvı 24 saat müddetle F kabında toplanır ve çok iyi karıştırıldıktan sonra numune alınır. Bu işlemi takiben F kabı dikkatlice temizlenir.

1.6. Ölçme donanımının kontrolü

Sentetik pis suyun mg/L cinsinden MBAS muhtevası, kullanımdan hemen önce tayin edilmelidir.

24 saat süreyle F kabında toplanmış bulunan sıvıdan alınan numunenin mg/L cinsinden MBAS muhtevası, hiç beklenilmeden, bir önceki tayinde uygulanan metoda göre analitik olarak tayin edilir. Tayin hemen yapılamayacaksa, numuneler tercihen dondurularak korunmalıdır. MBAS muhtevası 0.1 mg/L yaklaşımla verilmelidir.

Prosesin verimliliğini kontrol amacıyla, F kabında toplanan sıvı ile A kabındaki sentetik pis suyun kimyasal oksijen ihtiyacı (COD) veya çözünmüş organik karbon (DOC) muhtevası, haftada en az iki defa, cam elyaf süzgeçten süzülmüş numuneler üzerinde tayin edilir.

Şekil 3’te görüldüğü gibi, ön işlem periyodu sonunda, MBAS’taki günlük parçalanabilirlik değerleri düzenli hale geldiğinde, DOC veya COD değerlerindeki azalma hemen hemen sıfıra inmelidir.

Havalandırma kabındaki aktif çamur içinde asılı halde bulunan katıların kuru madde muhtevası (g/L) haftada iki defa tayin edilmelidir. Kuru madde muhtevası 2.5 g/L’den fazla ise, çamurun bir bölümü alınmalıdır.

Deney, oda sıcaklığında yapılır. Ancak, sıcaklık kararlı durumda olmalı ve 19 ⁰C–24 ⁰C (292 K- 297 K)  aralığında tutulmalıdır.

1.7. Biyolojik parçalanabilirliğin hesaplanması

MBAS’taki parçalanma yüzdesi, günlük olarak, sentetik pis suyun ve F kabında toplanan sıvının mg/L cinsinden MBAS muhtevası temel alınarak hesaplanmalıdır. Elde edilen parçalanabilirlik değerleri, Şekil 3’te gösterildiği gibi grafiğe geçirilir.

MBAS’ın parçalanabilirliği, ön işlem periyodundan sonra gelen, parçalanmanın düzenli olduğu ve donanımın problemsiz olarak çalıştırıldığı 21 günlük periyot boyunca elde edilmiş değerlerin aritmetik ortalaması olarak hesaplanmalıdır. Ön işlem periyodu, hiç bir durumda altı haftayı geçmemelidir. Günlük parçalanma değerleri % 0.1 yaklaşımla hesaplanmalı, ancak nihai değer en yakın tam sayıya yuvarlatılarak verilmelidir.

Bazı durumlarda, numune alma sıklığı azaltılabilir, ancak ortalama değerin hesaplanmasında, ön işlem periyodundan sonra gelen 21 günlük periyot boyunca alınmış en az 14 adet numune kullanılmalıdır.

BÖLÜM 2

Deneye tabi tutulacak ürünlerin ön işlemden geçirilmesi

2.1. Ön bilgiler

2.1.1. Numunelerin işlemden geçirilmesi

Referans metodu için biyolojik parçalanabilirliğin tayininden önce, anyonik yüzey aktif maddelere ve formüle edilmiş deterjanlara uygulanacak işlem aşağıdaki çizelgede belirtilmiştir:

Alkolle ekstraksiyon yapılmasının nedeni, ticari ürünlerde bulunan ve bazı durumlarda biyolojik parçalanabilirliği bozabileceği düşünülen inorganik ve çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmaktır.

2.1.2. İyon değiştirme işlemi

Doğru bir biyolojik parçalanabilirlik deneyinin yapılabilmesi için, sabundan, noniyonik ve katyonik yüzey aktif maddelerden anyonik yüzey aktif maddelerin izole edilmesi ve ayrılması gerekir. Bu işlem, kademeli elüsyon için uygun elutant ve kaba gözenekli iyon değiştirici reçine kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şekilde, sabun, anyonik ve noniyonik yüzey aktif maddeler tek bir işlemle izole edilebilir.

2.1.3. Analitik kontrol

Homojenleştirme işleminden sonra, deterjandaki anyonik yüzey aktif madde derişimi,  MBAS analitik tayin işlemine göre belirlenir. Sabun muhtevası uygun bir analitik metodla tayin edilir. Biyolojik parçalanabilirlik deneyleri için gerekli olan fraksiyonların hazırlanmasında ihtiyaç duyulan miktarların hesaplanabilmesi için, üründe bu analizin yapılması gereklidir.

Yüzey aktif maddelerin kantitatif olarak (bütünüyle) ekstrakte edilmesine gerek yoktur. Ancak, anyonik yüzey aktif maddelerin en az % 80’i ekstrakte edilmelidir. Normal olarak, ekstrakte edilen madde oranı %  90 veya daha fazladır.

2.2. Prensip

Homojen bir sentetik deterjan numunesinden (toz, kurutulmuş krem ve kurutulmuş sıvı şeklinde) etanolle ekstraksiyon yoluyla deterjanda bulunan yüzey aktif maddeler ile sabun ve alkolde çözünür diğer bileşenler ekstrakte edilir.

Etanol ekstraktı kuruluğa kadar buharlaştırılır, izopropanol/su karışımında çözülür ve elde edilen çözelti, 50 ⁰C  (323 K)’e ısıtılmış kuvvetli asidik katyon değiştirici/iri gözenekli anyon değiştirici kombinasyonundan geçirilir. Bu işlemin 50 ⁰C gibi  yüksek sıcaklıkta yapılmasının sebebi, asidik ortamda bulunması muhtemel yağ asitlerinin çökelmesini önlemektir.

Deterjanda olabilecek noniyonik yüzey aktif maddeler çözeltidedir.

Sabun yağ asitleri, CO₂ içeren etanol elüsyonu ile ayrılır. Anyonik yüzey aktif maddeler, izopropanol ve su karışımında hazırlanmış amonyum bikarbonat çözeltisi ile amonyum tuzları olarak elde edilir. Biyolojik parçalanabilirlik deneylerinde bu tuzlar kullanılır.

Parçalanma deneyini ve analitik işlemi bozabilecek katyonik yüzey aktif maddeler, anyon değiştirici üzerine yerleştirilmiş katyon değiştirici tarafından uzaklaştırılır.

2.3. Reaktifler, cihaz ve malzemeler

2.3.1. Deiyonize su

2.3.2. Etanol (C₂H₅OH), % 95’lik (hacim/hacim)  (izin verilebilen denatüre edici madde: Metil etil keton veya metanol).

2.3.3. İzopropanol (CH₃CHOH-CH₃)/ su karışımı, 50+50’lik (hacim/hacim). 

Bu karışım, hacimce 50 kısım izopropanolun, 50 kısım su (Madde 2.3.1) ile karıştırılmasıyla hazırlanır.

2.3.4. Etanol, karbondioksitli, yaklaşık % 0.1 CO₂ içeren.

Bu çözelti, etanol (Madde 2.3.2) içerisinden gözenekli bir tüp yardımıyla 10 dakika müddetle CO₂ gazı geçirilerek hazırlanır. Sadece yeni hazırlanmış çözeltiler kullanılmalıdır.

2.3.5. Amonyum bikarbonat (NH₄HCO₃) çözeltisi, 60/40’lik ((hacim/hacim). 

Bu çözelti 0.3 mol amonyum bikarbonatın, hacimce 60 kısım izopropanol ve 40 kısım su (Madde 2.3.1) içeren 1000 mL’lik bir karışım içinde çözülmesiyle hazırlanır.

2.3.6. Katyon değiştirici (KAT), kuvvetli asidik, alkole dayanıklı, tane boyu (50 –100) mesh olan.

2.3.7. Anyon değiştirici (AAT), kaba gözenekli, Merck Lewait MP 7080 (tane boyu 70-150 mesh) veya eşdeğeri.

2.3.8. Hidroklorik asit (HCl) çözeltisi, % 10’luk (ağırlık/ağırlık).

2.3.9. Balon, 2000 mL’lik, dibi yuvarlak, traşlanmış cam tapalı, üzerinde geri soğutucu bulunan.

2.3.10. Emme süzgeci (Nuçe hunisi), ısıtılabilir, 90 mm çapında, süzgeç kâğıdı için.

2.3.11. Süzme erleni (Nuçe erleni), 2000 mL’lik.

2.3.12. İyon değiştirme kolonları, ısıtma ceketli ve musluklu, iç tüpünün çapı 60 mm ve yüksekliği 450 mm olan (Bkz. Şekil 4).

2.3.13. Su banyosu

2.3.14. Etüv, vakumlu.

2.3.15. Termostat

2.3.16. Döner buharlaştırıcı

2.4. Ekstraktın hazırlanması ve anyonik yüzey aktif maddelerin ayrılması

2.4.1. Ekstraktın hazırlanması

Biyolojik parçalanabilirlik deneyi için gerekli olan yüzey aktif madde miktarı yaklaşık 50 gr MBAS ‘tır.

Ekstrakte edilecek ürün miktarı normal şartlarda 1000 g’ı geçemez. Ancak, yeteri kadar ekstrakt elde edilebilmesi için ilâve numune kullanımı gerekebilir. Kolaylık açısından, parçalanma deneyi için ekstrakt hazırlamakta kullanılacak ürün miktarı 5000 g’la sınırlandırılmalıdır.

Deneyimler, büyük miktarlarda çalışılarak tek bir ekstraksiyon yapmak yerine, küçük miktarlarda ancak fazla sayıda ekstraksiyon yapmanın daha avantajlı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Belirtilen iyon değiştirici miktarları, (600-700) mmol yüzey aktif madde ve sabunla çalışılacak şekilde tasarımlanmıştır.

2.4.2. Alkolde çözünür maddelerin izole edilmesi

Analize tabi tutulacak sentetik deterjandan 250 g alınır, 1250 mL etanol içine ilave edilir, karışım kaynama noktasına kadar ısıtılır ve sürekli karıştırılmak suretiyle bir saat müddetle geri soğutucu altında kaynatma işlemine devam edilir. Sıcak alkollü çözelti, sıcaklığı 50 ⁰C (323 K)’de tutulan kaba gözenekli emme süzgecinden hızla süzülür. Balon ve emme süzgeci yaklaşık 200 mL sıcak etanol ile yıkanır. Yıkama sıvıları da süzüntünün olduğu erlende (Madde 2.3.11) toplanır.

Krem veya sıvı haldeki ürünlerin analizinde, numunede 55 g’dan fazla anyonik yüzey aktif madde veya 35 g’dan fazla sabun bulunmadığına dikkat edilmelidir. Tartılmış numune kuruluğa kadar buharlaştırılır. Kalıntı 2000 mL etanol içinde çözülür ve yukarıda belirtilen işlemler uygulanır.

Yoğunluğu düşük olan toz deterjanlar için etanollü süzüntü, tercihen bir döner kurutucu ile kuruluğa kadar buharlaştırılır. Daha büyük miktarda ekstrakt elde edilmesi gerekiyorsa, bu işlem tekrarlanır. Kalıntı, 5000 mL izopropanol/su karışımında çözülür.

2.4.3. İyon değiştirme kolonlarının hazırlanması

Katyon değiştirme kolonu

600 mL katyon değiştirici reçine (Madde 2.3.6) 3000 mL’lik behere alınır ve üzerine 2000 mL hidroklorik asit (Madde 2.3.8) ilâve edilir. Ara sıra karıştırılarak en az 2 saat beklenir. Asit boşaltılır ve reçine deiyonize su ile kolona (Madde 2.3.12) alınır. Kolonun, cam yününden yapılmış bir tapası bulunmalıdır. Kolon, eluatta (kolondan alınan sıvıda) klorür iyonları bulunmayıncaya kadar deiyonize su ile (10-30) mL/min akış hızı altında yıkanır. Kolondan, 10-30 mL/min akış hızı altında 2000 mL izopropanol/su karışımı geçirilir. Katyon değiştirme kolonu, bu işlemden sonra kullanıma hazır hale gelmiştir.

Anyon değiştirme kolonu

600 mL anyon değiştirme reçinesi (Madde 2.3.7) 3000 mL’lik bir behere alınır ve üzerine 2000 mL deiyonize su ilâve edilir. Reçinenin şişmesi için en az 2 saat beklenir. Reçine deiyonize su ile kolona aktarılır. Kolonun cam yününden yapılmış bir tapası olmalıdır. Kolon, klorür iyonları tamamen uzaklaştırılıncaya kadar 0.3 M amonyum bikarbonat çözeltisi (Madde 2.3.5) ile yıkanır. Bu işlem yaklaşık 5000 mL çözelti kullanılmasını gerektirir. Kolon, 2000 mL deiyonize su ile tekrar yıkanır ve içinden (10-30) mL/min akış hızı altında 2000 mL izopropanol/ su karışımı (Madde 2.3.3) geçirilir. Bu işlemden sonra kolon OH formundadır ve kullanıma hazırdır.

2.4.4. İyon değiştirme işlemi

Katyon değiştirme kolonu anyon değiştirme kolonunun üstünde olacak şekilde, kolonlar birbirine bağlanır. Kolonlar, termostat kontrollü olarak 50 ⁰C (323 K)’e ısıtılır. Madde 2.4.2’de elde edilen çözeltinin 5000 ml’si  60 ⁰C (333 K)’e ısıtılır ve daha sonra 20 mL/ min akış hızı altında kolonlardan geçirilir. Kolonlar 1000 mL sıcak izopropanol/ su karışımı (Madde 2.3.3) ile yıkanır.

Ayonik yüzey aktif maddelerin (MBAS) elde edilebilmesi için, KAT kolonu sökülür. Kolon içinden, 50 ⁰C (323 K) sıcaklıkta 5000 mL etanol/CO₂ çözeltisi (Madde 2.3.4) geçirilerek sabun yağ asitleri kolon dışına alınır. Çözelti atılır.

AAT kolonundaki MBAS muhtevası, kolon içinden 5000 mL amonyum bikarbonat çözeltisi (Madde 2.3.5) geçirilerek dışarı alınır. Çözelti, bir buhar banyosunda veya döner buharlaştırıcıda kuruluğa kadar buharlaştırılır. Elde edilen kalıntıda, MBAS (amonyum tuzları şeklinde) ve yüzey aktif madde niteliği taşımayan muhtemel anyonlar bulunur. Bu anyonlar, biyolojik parçalanabilirlik testi üzerinde olumsuz bir etki yaratmaz. Kalıntıya, belirli bir hacim elde edilinceye kadar deiyonize su ilâve edilir ve MBAS muhtevası Bölüm 3’te belirtildiği şekilde tayin edilir.

Bu çözelti, biyolojik parçalanabilirlik deneylerinde anyonik sentetik deterjan standard çözeltisi olarak kullanılır. Çözelti, 5 ⁰C (278 K)’in altında muhafaza edilmelidir.

2.4.5. İyon değiştirme reçinelerin rejenerasyonu

Katyon değiştirici reçine kullanımdan sonra atılır.

Anyon değiştirici reçine, eluatta anyonik yüzey aktif madde kalmayıncaya kadar (metilen mavisi deneyi ile belirlenir), kolon içinden yaklaşık 10 mL/min akış hızı altında yukardan aşağıya doğru ilâve amonyum bikarbonat çözeltisi (Madde 2.3.5) geçirilerek rejenere edilir. Son olarak, kolon, yukardan aşağıya doğru 2000 mL izopropanol/su karışımı (Madde 2.3.3) geçirilerek yıkanır. Bu işlemden sonra, anyon değiştirici tekrar kullanıma hazırdır.

BÖLÜM 3

Biyolojik parçalanabilirlik testinde anyonik yüzey aktif maddelerin tayini

3.1. Prensip

Tayin metodu, boyar özelliklere sahip katyonik metilen mavisinin, anyonik yüzey aktif maddelerle reaksiyona girerek kloroformla ekstrakte edilebilen mavi renkli tuzlar oluşturması prensibine dayanır. Girişimleri önlemek için, önce alkali çözeltiyle ekstraksiyon yapılır ve elde edilen ekstrakt asidik metilen mavisi çözeltisi ile çalkalanır. Ayrılan organik fazın absorbansı, absorpsiyonun maksimum olduğu 650 nm dalga boyunda fotometrik olarak ölçülür.

3.2. Reaktifler, cihaz ve malzemeler

3.2.1 Tampon çözelti, pH=10 olan.

Bu çözelti, analitik saflıkta 24 g sodyum bikarbonat (NaHCO₃) ve analitik saflıkta 27 g susuz sodyum karbonatın (Na₂CO₃) deiyonize su içinde çözülmesi ve çözeltinin su ile 1000 mL’ye seyreltilmesiyle hazırlanır.

3.2.2. Metilen mavisi çözeltisi, nötral.

Analitik saflıkta 0.35 g metilen mavisi deiyonize su içinde çözülür ve su ile 1000 mL’ye seyreltilir. Çözelti, kullanımdan en az 24 saat önce hazırlanmalıdır. Kloroforma karşı ölçülen şahit kloroform fazının absorbansı, 650 nm dalga boyunda her 1 cm optik yol için 0.015’i geçmemelidir.

3.2.3. Metilen mavisi çözeltisi, asidik.

Analitik saflıkta 0.35 g metilen mavisi 500 mL deiyonize su içinde çözülür ve 6.5 mL sülfürik asit (d=01.84 g/mL) ile karıştırılır. Çözelti, deiyonize su ile 1000 mL’ye seyreltilir. Çözelti kullanımdan en az 24 saat önce hazırlanmalıdır. Kloroforma karşı ölçülen şahit kloroform fazının absorbansı, 650 nm dalga boyunda her 1 cm optik yol için 0.015’i geçmemelidir.

3.2.4. Kloroform (triklormetan), analitik saflıkta, yeni damıtılmış.

3.2.5. Dodesil benzen sülfonik asit metil ester

3.2.6. Potasyum hidroksit çözeltisi, 0.1 M, etanolde çözülerek hazırlanmış.

3.2.7. Etanol (C₂H₅OH), mutlak

3.2.8. Sülfürik asit (H₂SO₄) çözeltisi, 0.5 M.

3.2.9. Fenolftaleyn çözeltisi

Bu çözelti, 1 g fenolftaleynin 50 mL etanol içinde çözülmesi ve çözeltiye devamlı karıştırılmak suretiyle 50 mL deiyonize su ilâve edilmesi suretiyle hazırlanır. Çökelek oluşursa, süzülerek uzaklaştırılır.

3.2.10. Hidroklorik asit (HCl) çözeltisi, metanolde çözülmüş.

Bu çözelti, analitik saflıkta 250 mL hidroklorik asitin  750 mL metanol içinde çözülmesi ile hazırlanır.

3.2.11. Ayırma hunisi, 250 mL’lik.

3.2.12. Ölçülü balon, 50 mL’lik.

3.2.13. Ölçülü balon, 500 mL’lik.

3.2.14. Ölçülü balon, 1000 mL’lik.

3.2.15. Balon, 250 mL’lik, yuvarlak dipli, traşlanmış bir cam tapası bulunan, geri soğutuculu, kaynatma taşları ile birlikte.

3.2.16. pH metre

3.2.17. Fotometre, 650 nm’de ölçme yapmak için, (1 -5) cm optik yola sahip hücreleri bulunan.

3.2.18. Kalitatif süzgeç kâğıtları

3.3. İşlem

Analize tabi tutulacak numuneler, köpük seviyesinden alınmamalıdır. Analizlerde kullanılacak araç ve gereç su ile iyice yıkandıktan sonra, kullanılmadan önce, metanollü hidroklorik asit (Madde 3.2.10) ve arkasından deiyonize su ile çok iyi durulanır.

Aktif çamur tesisine giren ve çıkan sıvılardan alınan numuneler hiç beklenilmeden süzülür ve ilk 100 mL’lik süzüntüler atılır.

Bilinen hacimde numune, gerekirse nötralleştirilerek, 250 mL’lik ayırma hunisine (Madde 3.2.11) alınır. Numunede (20-150) μg MBAS bulunmalıdır. MBAS muhtevası düşük olan numunelerde, numune miktarı 100 mL’ye kadar artırılabilir. Numune hacmi 100 mL’den az ise, numune deiyonize su ile 100 mL’ye kadar seyreltilir. Numuneye, 10 mL tampon çözeltisi (Madde 3.2.1), 5 mL nötral metilen mavisi çözeltisi (Madde 3.2.2) ve 15 mL kloroform (Madde 3.2.4) ilâve edilir. Karışım, çok şiddetli olmamak kaydıyla, 1 dakika müddetle düzgünce çalkalanır. Faz ayrılmasından sonra, kloroform tabakası, içinde 110 mL deiyonize su ve 5 mL asidik metilen mavisi çözeltisi (3.2.3) bulunan ikinci bir ayırma hunisine alınır. Karışım 1 dakika müddetle karıştırılır. Kloroform tabakası, önceden temizlenmiş ve kloroform ile ıslatılmış bulunan bir pamuk süzgeçten geçirilerek ölçülü balona (Madde 3.2.12) alınır.

Alkali ve asidik çözeltiler, ikinci ve üçüncü ekstraksiyonlarda 10’ar mL kloroform kullanılarak üç kez ekstrakte edilir. Birleştirilen kloroform ekstraktları aynı pamuk süzgeçten süzülerek 50 mL’lik balona (Madde 3.2.12) eklenir ve pamuk-yün süzgecin yıkanmasında kullanılan kloroform ile 50 mL çizgisine kadar seyreltilir.

Kloroform çözeltisinin absorbansı, (1-5) cm optik yollu hücrelere sahip fotometre (Madde 3.2.17) ile 650 nm dalga boyunda kloroforma karşı ölçülür.

Yukarıda belirtilen tüm işlemler uygulanarak, numune kullanılmaksızın bir şahit deney yapılır.

3.4. Kalibrasyon eğrisinin hazırlanması

Potasyumla sabunlaştırılmış standart dodesil benzen sülfonik asit metil ester (tetrapropilen tipinde, molekül ağırlığı:340) çözeltisinden bir kalibrasyon çözeltisi hazırlanır. MBAS muhtevası, sodyum dodesil benzen sülfonat (molekül ağırlığı:348) olarak hesaplanır.

Tartım pipeti kullanılarak (400-450) mg dodesil benzen sülfonik asit metil ester (Madde 3.2.5) 0.1 mg yaklaşımla yuvarlak tabanlı balona alınır ve içine 50 mL etanollü potasyum hidroksit çözeltisi (Madde 3.2.6) ile bir kaç kaynatma taşı konur. Geri soğutucu takılır ve karışım bir saat müddetle kaynatılır. Soğutulduktan sonra, geri soğutucu ve traşlanmış cam bağlantı yaklaşık 30 mL etanol ile balon içine yıkanır. Çözelti, renksiz hale gelinceye kadar fenolftaleyn indikatörüne karşı sülfürik asit ile titre edilir. Çözelti daha sonra 1000 mL’lik ölçülü balona (Madde 3.2.14) aktarılır, işaret çizgisine kadar deiyonize su ile seyreltilir ve karıştırılır.

Bu yüzey aktif madde stok çözeltisinin bir kısmı tekrar seyreltilir. Bunun için, çözeltiden 25 mL’lik bir kısım alınır, 500 mL’lik ölçülü balona (Madde 3.2.13) aktarılır, deiyonize su ile işaret çizgisine kadar seyreltilir ve karıştırılır.

Bu standard çözeltinin 1 mL’sinde   E x 1.023             mg MBAS bulunur.

                                               20000

Burada;

E: mg cinsinden numune kütlesidir.

Kalibrasyon grafiğinin hazırlanabilmesi için, standard çözeltiden 1 mL, 2 mL, 4 mL, 6 mL ve 8 mL’lik kısımlar alınır ve her biri deiyonize su ile 100 mL’ye seyreltilir ve daha sonra Madde 3.3’te verilen işlem (şahit deney işlemi dahil) uygulanır.

3.5. Sonuçların hesaplanması

Numunenin anyonik yüzey aktif madde (MBAS) miktarı kalibrasyon grafiğinden (Madde 3.4) okunur. Numunenin MBAS muhtevası aşağıdaki gibi hesaplanır:

Anyonik yüzey aktif madde miktarı (MBAS mg/L olarak) =   mg MBAS x 1000

                                                                                      V

Burada;

V: Kullanılan numunenin mL cinsinden hacmidir.

Sonuçlar, sodyum dodesil benzen sülfonat (MA 348) olarak verilir.

3.6. Sonuçların gösterilmesi

Sonuçlar 0.1 MBAS mg/L yaklaşımla, MBAS mg/L cinsinden ifade edilir.

EK- 2

NONİYONİK YÜZEY AKTİF MADDELERİN BİYOLOJİK PARÇALANABİLİRLİK ORANININ  TAYİNİ

Referans metod

BÖLÜM 1

1.1. Tanım

Bu metotta “noniyonik yüzey aktif maddeler” teriminden,  katyonik ve anyonik iyon değiştiricilerden geçirildikten sonra, Bölüm 3’te verilen analitik işleme göre bizmut aktif madde (BiAS) olarak tayin edilen maddeler anlaşılır.

1.2..Ölçmeler için gereken deney donanımı

Ölçme işleminde, genel hatları Şekil 1’de ve ayrıntıları Şekil 2’de verilen deney donanımı (küçük bir aktif çamur tesisi) kullanılır. Donanım, aşağıda belirtilen kısımlardan oluşur:

-          Sentetik pis su deposu A: Sentetik pis suyu depolamak için, 

-          Besleme ayar pompası B,

-          Havalandırma kabı C,

-          Çöktürme kabı D,

-          Hava pompası E: Aktif çamurun C kabına tekrar tekrar beslenmesini sağlamak için,

-          Kap F: İşlemden geçirilmiş suyu depolamak için.

A ve F kapları camdan veya uygun bir plastikten yapılmış olmalı ve en az 24 litrelik bir hacme sahip olmalıdır. B pompası, sentetik pis suyu, havalandırma kabına sabit bir debide gönderebilmelidir. Bu kap, normal işletim esnasında, üç litre sıvı karışım ihtiva eder. C kabının koni şeklindeki taban kısmının üst bölgesinde asılı halde gözenekli (sinterlenmiş) bir G havalandırma küpü bulunur. Havalandırıcıdan geçirilen hava miktarı, H debi ölçeriyle sürekli izlenmelidir.

1.3. Sentetik pis su

Deneyde, sentetik olarak hazırlanmış pis su kullanılır. Bu amaçla, her bir litre çeşme suyunda, aşağıda belirtilen maddelerden karşılarında belirtilen  miktarlarda madde çözülmüş olacak şekilde, deneylere yetecek miktarda pis su çözeltisi hazırlanır.

BiAS, deneye tabi tutulacak üründen, Bölüm  2’de verilen metoda göre ekstrakte edilir.

Sentetik pis su, kullanılacağı gün hazırlanmalıdır.

1.4. Numunelerin hazırlanması

1.4.1. Tek tip (başka maddeler katılmamış) yüzey aktif maddeler, olduğu haliyle deneye tabi tutulabilir. Sentetik pis su (Madde 1.3) hazırlanabilmesi için, numunenin BiAS muhtevasının bilinmesi gereklidir.

1.4.2. Formüle edilmiş ürünler, BiAS, MBAS ve sabun muhtevası açısından analize tabi tutulmalıdır. Bu tür ürünler, alkolle ekstrakte edilmeli ve  BiAS muhtevası ayrılmalıdır (Bkz. Bölüm 2). Sentetik pis suyun hazırlanabilmesi için BiAS muhtevasının bilinmesi gereklidir.

1.5. Deney donanımının çalıştırılması

İlk olarak, C havalandırma kabı ve D çöktürme kabı sentetik pis su ile doldurulur. D kabının yüksekliği, C havalandırma kabının hacmi üç litre olacak şekilde sabitlenir. Esas itibariyle evsel kaynaklı pis suların işlendiği bir pis su arıtma tesisinden yeni alınmış, iyi kalitede 3 mL’lik ikinci kademe sıvı atığı sentetik pis suya ilave edilerek aşılama yapılır. Bu aşılama sıvısı, numune alma ve uygulama işlemleri arasında aerobik şartlarda (havalandırılarak) muhafaza edilmelidir. Aşılamadan sonra, G havalandırıcısı, E hava pompası ve B besleme ayar pompası çalıştırılır. Sentetik pis su, besleme debisi 1 litre/saat olacak şekilde, C havalandırma kabından geçirilir. Bu şekilde, pis suyun C kabındaki ortalama alıkonma süresi üç saate ayarlanmış olur. Havalandırma hızı, C kabındaki karışım sürekli süspansiyon halinde kalacak ve çözünmüş oksijen muhtevası en az 2 mg/L olacak şekilde ayarlanır. Bu esnada, uygun yollarla köpüklenme önlenmelidir. Aktif çamuru inhibe eden veya BiAS içeren köpük önleyici maddeler kullanılmamalıdır. E hava pompası, çöktürme kabındaki aktif çamur, C havalandırma kabına sürekli ve düzenli olarak  tekrar beslenecek şekilde ayarlanır. C havalandırma kabının üst kısmında, D çöktürme kabının tabanında veya dolaşım hattında birikmiş çamur, fırça veya başka uygun bir metod ile, günde en az bir defa kazınarak dolaşıma verilmelidir. Çamurda çökelme durduğunda, 2 mL’lik kısımlar halinde % 5’lik demir (III) klorür çözeltisi ilave edilerek çökelme arttırılabilir. Gerektiğinde, bu işlem tekrar edilir.

D çöktürme kabından taşan sıvı 24 saat müddetle F kabında toplanır ve çok iyi karıştırıldıktan sonra numune alınır. Bu işlemi takiben F kabı dikkatlice temizlenir.

1.6. Ölçme donanımının kontrolü

Sentetik pis suyun mg/L cinsinden BiAS muhtevası, kullanımdan hemen önce tayin edilmelidir.

24 saat süreyle F kabında toplanmış bulunan sıvıdan alınan numunenin mg/L cinsinden BiAS muhtevası, hiç beklenilmeden, bir önceki tayinde uygulanan metoda göre analitik olarak tayin edilir. Tayin hemen yapılamayacaksa, numuneler tercihen dondurularak korunmalıdır. BiAS muhtevası 0.1 mg/L yaklaşımla verilmelidir.

Prosesin verimliliğini kontrol amacıyla, F kabında toplanan sıvı ile A kabındaki sentetik pis suyun kimyasal oksijen ihtiyacı (COD) veya çözünmüş organik karbon (DOC) muhtevası, haftada en az iki defa, cam elyaf süzgeçten süzülmüş numuneler üzerinde tayin edilir.

Şekil 3’te görüldüğü gibi, ön işlem periyodu sonunda, BiAS’taki günlük parçalanabilirlik değerleri düzenli hale geldiğinde, DOC veya COD değerlerindeki azalma hemen hemen sıfıra inmelidir.

Havalandırma kabındaki aktif çamurda haftada iki defa  kuru madde tayini (g/L) yapılmalıdır. Kuru madde muhtevası 2.5 g/L’den fazla ise, çamurun bir bölümü alınmalıdır.

Parçalanma deneyi oda sıcaklığında yapılır. Ancak, sıcaklık kararlı durumda olmalı ve 19 ⁰C–24 ⁰C (292 K-297 K)  aralığında tutulmalıdır.

1.7. Biyolojik parçalanabilirliğin hesaplanması

BiAS’taki parçalanma yüzdesi, günlük olarak, sentetik pis suyun ve F kabında toplanan sıvının mg/L cinsinden BiAS muhtevası temel alınarak hesaplanmalıdır. Elde edilen parçalanabilirlik değerleri, Şekil 3’te gösterildiği gibi grafiğe geçirilir.

BiAS’ın parçalanabilirliği, ön işlem periyodundan sonra gelen, parçalanmanın düzenli olduğu ve donanımın problemsiz olarak çalıştırıldığı 21 günlük periyot boyunca elde edilmiş değerlerin aritmetik ortalaması olarak hesaplanmalıdır. Ön işlem periyodu, hiç bir durumda altı haftayı geçmemelidir. Günlük parçalanma değerleri % 0.1 yaklaşımla hesaplanmalı, ancak nihai değer en yakın tam sayıya yuvarlatılarak verilmelidir.

Bazı durumlarda, numune alma sıklığı azaltılabilir, ancak ortalama değerin hesaplanmasında, ön işlem periyodundan sonra gelen 21 günlük periyot boyunca alınmış en az 14 adet numune kullanılmalıdır.

BÖLÜM 2

Deneye tabi tutulacak ürünlerin ön işlemden geçirilmesi

2.1 Ön bilgiler

2.1.1 Numunelerin işlemden geçirilmesi

Referans metod için biyolojik parçalanabilirliğin tayininden önce, noniyonik yüzey aktif maddelere ve formüle edilmiş deterjanlara uygulanacak işlem aşağıdaki çizelgede belirtilmiştir:

Alkolle ekstraksiyon yapılmasının nedeni, ticari ürünlerde bulunan ve bazı durumlarda biyolojik parçalanabilirliği bozabileceği düşünülen inorganik ve çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmaktır.

2.1.2. İyon değiştirme işlemi

Doğru bir biyolojik parçalanabilirlik deneyinin yapılabilmesi için, sabundan, anyonik ve katyonik yüzey aktif maddelerden noniyonik yüzey aktif maddelerin izole edilmesi ve ayrılması gerekir. Bu işlem, kademeli elusyon için uygun elutant ve kaba gözenekli iyon değiştirici reçine kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şekilde, sabun, anyonik ve noniyonik yüzey aktif maddeler tek bir işlemle izole edilebilir.

2.1.3. Analitik kontrol

Homojenleştirme işleminden sonra, deterjandaki anyonik ve noniyonik yüzey aktif madde derişimleri, sırasıyla MBAS ve BiAS analitik tayin metotlarına göre belirlenir. Sabun muhtevası uygun bir analitik metotla tayin edilir. Biyolojik parçalanabilirlik deneyleri için gerekli olan fraksiyonların hazırlanmasında ihtiyaç duyulan miktarların hesaplanabilmesi için, üründe bu analizin yapılması gereklidir.

Yüzey aktif maddelerin kantitatif olarak (tamamıyla) ekstrakte edilmesine gerek yoktur. Ancak, noniyonik yüzey aktif maddelerin en az %  80’i ekstrakte edilmelidir. Normal olarak, ekstrakte edilen madde oranı % 90 veya daha fazladır.

2.2. Prensip

Homojen bir deterjan numunesinden (toz, kurutulmuş krem ve kurutulmuş sıvı şeklinde) etanolle ekstraksiyon yoluyla deterjanda bulunan yüzey aktif maddeler ile sabun ve alkolde çözünür diğer bileşenler ekstrakte edilir.

Etanol ekstraktı kuruluğa kadar buharlaştırılır, izopropanol/su karışımında çözülür ve elde edilen çözelti, 50 ⁰C  (323 K)’e ısıtılmış kuvvetli asidik katyon değiştirici/iri gözenekli anyon değiştirici kombinasyonundan geçirilir. Bu işlemin 50 ⁰C gibi  yüksek sıcaklıkta yapılmasının sebebi, asidik ortamda bulunması muhtemel yağ asitlerinin çökelmesini önlemektir.

Çözelti buharlaştırılarak noniyonik yüzey aktif maddeler elde edilir.

Parçalanma deneyini ve analitik işlemi bozabilecek katyonik yüzey aktif maddeler, anyon değiştirici üzerine yerleştirilmiş katyon değiştirici tarafından elimine edilir.

2.3. Reaktifler, cihaz ve malzemeler

2.3.1. Deiyonize su

2.3.2. Etanol (C₂H₅OH), % 95’lik (hacim/hacim) (izin verilebilir denature edici madde: Metil etil keton veya metanol).

2.3.3. İzopropanol (CH₃CHOH-CH₃)/ su karışımı, 50+50’lik  (hacim/hacim).

Bu karışım, hacimce 50 kısım izopropanolun, 50 kısım su (Madde 2.3.1) ile karıştırılmasıyla hazırlanır.

2.3.4. Amonyum bikarbonat (NH₄HCO₃) çözeltisi, 60/40’lik (hacim/hacim).

Bu çözelti 0.3 mol amonyum bikarbonatın, hacimce 60 kısım izopropanol ve 40 kısım su (Madde 2.3.1) içeren 1000 mL’lik bir karışım içinde çözülmesiyle hazırlanır.

2.3.5. Katyon değiştirici (KAT), kuvvetli asidik, alkole dayanıklı, tane boyu (50 –100) mesh olan.

2.3.6. Anyon değiştirici (AAT), kaba gözenekli, Merck Lewait MP 7080 (tane boyu 70-150 mesh) veya eşdeğeri.

2.3.7. Hidroklorik asit (HCl) çözeltisi, % 10’luk (ağırlık/ağırlık).

2.3.8. Balon, 2000 mL’lik, dibi yuvarlak, traşlanmış cam tapalı, geri soğutuculu.

2.3.9. Emme süzgeci (Nuçe hunisi), ısıtılabilir, 90 mm çapında, süzgeç kâğıdı için.

2.3.10. Süzme erleni (Nuçe erleni), 2000 mL’lik.

2.3.11. İyon değiştirici kolonlar, ısıtma ceketli ve musluklu, iç tüpünün çapı 60 mm ve yüksekliği 450 mm olan (Bkz. Şekil 4).

2.3.12. Su banyosu

2.3.13. Etüv, vakumlu.

2.3.14. Termostat

2.3.15. Döner buharlaştırıcı

2.4. Ekstraktın hazırlanması ve noniyonik yüzey aktif maddelerin ayrılması

2.4.1. Ekstraktın hazırlanması

Biyolojik parçalanabilirlik deneyi için gerekli olan yüzey aktif madde miktarı , yaklaşık 25 g BiAS ‘tır.

Biyolojik parçalanabilirlik deneyi için ekstrakt hazırlamakta kullanılacak ürün miktarı 2000 g’la sınırlandırılmalıdır. Bu sınırlama sebebiyle, parçalanma deneyine yetecek miktarda BiAS elde edilebilmesi için, iki veya daha fazla sayıda ekstraksiyon yapılması gerekebilir. Deneyimler, büyük miktarlarda çalışılarak tek bir ekstraksiyon yapmak yerine, küçük miktarlarda ancak fazla sayıda ekstraksiyon yapmanın daha avantajlı olduğunu ortaya çıkarmıştır.

2.4.2. Alkolde çözünür maddelerin izole edilmesi

Analize tabi tutulacak sentetik deterjandan 250 g alınır, 1250 mL etanol içine ilave edilir, karışım kaynama noktasına kadar ısıtılır ve sürekli karıştırılmak suretiyle bir saat müddetle geri soğutucu altında kaynatma işlemine devam edilir. Sıcak alkollü çözelti, sıcaklığı 50 ⁰C (323 K)’de tutulan kaba gözenekli emme süzgecinden hızla süzülür. Balon ve emme süzgeci yaklaşık 200 mL sıcak etanol ile yıkanır. Yıkama sıvıları da süzüntünün olduğu erlende (Madde 2.3.11) toplanır.

Krem veya sıvı haldeki ürünlerin analizinde, numunede 25 g’dan fazla anyonik yüzey aktif madde veya 35 g’dan fazla sabun bulunmadığına dikkat edilmelidir. Tartılmış numune kuruluğa kadar buharlaştırılır. Kalıntı 500 mL etanol içinde çözülür ve yukarıda belirtilen işlemler uygulanır.

Yoğunluğu düşük olan toz deterjanlar için etanollü süzüntü, tercihen bir döner kurutucu ile kuruluğa kadar buharlaştırılır. Daha büyük miktarda ekstrakt elde edilmesi gerekiyorsa, bu işlem tekrarlanır. Kalıntı, 5000 mL izopropanol/su karışımında çözülür.

2.4.3. İyon değiştirme kolonlarının hazırlanması

Katyon değiştirme kolonu

600 mL katyon değiştirici reçine (Madde 2.3.5) 3000 mL’lik behere alınır ve üzerine 2000 mL hidroklorik asit (Madde 2.3.7) ilâve edilir. Ara sıra karıştırılarak en az 2 saat beklenir. Asit boşaltılır ve reçine deiyonize su ile kolona (Madde 2.3.11) alınır. Kolonun, cam yününden yapılmış bir tapası bulunmalıdır. Kolon, eluatta (kolondan alınan sıvıda) klorür iyonları bulunmayıncaya kadar deiyonize su ile (10-30) mL/min akış hızı altında yıkanır. Kolondan, 10-30 mL/min akış hızı altında 2000 mL izopropanol/ su karışımı geçirilir. Katyon değiştirme kolonu, bu işlemden sonra kullanıma hazır hale gelmiştir.

Anyon değiştirme kolonu

600 mL anyon değiştirme reçinesi (Madde 2.3.6) 3000 mL’lik bir behere alınır ve üzerine 2000mL deiyonize su ilâve edilir. Reçinenin şişmesi için en az 2 saat beklenir. Reçine deiyonize su ile kolona aktarılır. Kolonun cam yününden yapılmış bir tapası olmalıdır. Kolon, klorür iyonları tamamen uzaklaştırılıncaya kadar 0.3 M amonyum bikarbonat çözeltisi (Madde 2.3.4) ile yıkanır. Bu işlem yaklaşık 5000 mL çözelti kullanılmasını gerektirir. Kolon, 2000 mL deiyonize su ile tekrar yıkanır ve içinden (10-30) mL/min akış hızı altında 2000 mL izopropanol/su karışımı (Madde 2.3.3) geçirilir. Bu işlemden sonra kolon OH formundadır ve kullanıma hazırdır.

2.4.4. İyon değiştirme işlemi

Katyon değiştirme kolonu anyon değiştirme kolonunun üstünde olacak şekilde, kolonlar birbirine bağlanır. Kolonlar, termostat kontrollü olarak 50 ⁰C (323 K)’e ısıtılır. Madde 2.4.2’de elde edilen çözeltinin 5000 ml’si  60 ⁰C (333 K)’e ısıtılır ve daha sonra 20 mL/min akış hızı altında kolonlardan geçirilir. Kolonlar 1000 mL sıcak izopropanol/su karışımı (Madde 2.3.3) ile yıkanır.

Noniyonik yüzey aktif maddelerin elde edilebilmesi için, süzüntü ve yıkama sıvıları  toplanır ve tercihen döner kurutucu ile kuruluğa kadar buharlaştırılır. BiAS muhtevası elde edilen kalıntıdadır. Belirli bir hacim elde edilinceye kadar kalıntıya deiyonize su ilave edilir ve BiAS muhtevası Madde 3.3’te belirtildiği şekilde tayin edilir. Bu çözelti, biyolojik parçalanabilirlik deneylerinde noniyonik yüzey aktif madde standard çözeltisi olarak kullanılır. Çözelti, 5 ⁰C (278 K)’in altında muhafaza edilmelidir.

2.4.5. İyon değiştirme reçinelerinin rejenerasyonu

Katyon değiştirici reçine kullanımdan sonra atılır.

Anyon değiştirici reçine, eluatta anyonik yüzey aktif madde kalmayıncaya kadar (metilen mavisi deneyi ile belirlenir), kolon içinden yaklaşık 10 mL/min akış hızı altında yukardan aşağıya doğru (5000 -6000) mL amonyum bikarbonat çözeltisi (Madde 2.3.4) geçirilerek rejenere edilir. Son olarak, kolon, yukardan aşağıya doğru 2000 mL izopropanol/su karışımı (Madde 2.3.3) geçirilerek yıkanır. Bu işlemden sonra, anyon değiştirici tekrar kullanıma hazırdır.

BÖLÜM 3

Biyolojik parçalanalabilirlik deney sıvılarında noniyonik yüzey aktif madde tayini

3.1. Prensip

Yüzey aktif maddeler deriştirilir ve gaz ayırma yöntemi ile izole edilir. Kullanılan numunedeki noniyonik yüzey aktif madde miktarı (250-800) μg aralığında olmalıdır.

Ayrılan yüzey aktif madde etil asetatta çözülür.

Faz ayrılmasından ve çözücünün buharlaştırılmasından sonra, noniyonik yüzey aktif madde, modifiye Dragendorff reaktifi (KBiI₄+BaCl₂+buzlu asetik asit) ihtiva eden sulu çözelti içinde çöktürülür.

Çökelek süzülür, buzlu asetik asit ile yıkanır ve amonyum tartarat çözeltisinde çözünür. Çözeltideki bizmut, bir parlak plâtin indikatör elektrot ve bir kalomel veya gümüş/gümüş klorür referans elektrot kullanılarak,  pH değeri 4-5 arasında tutulan bir pirolidinditiyokarbamat çözeltisi ile potansiyometrik olarak titre edilir.

Bu metod, 6-30 aralığında alken oksit grupları ihtiva eden noniyonik yüzey aktif maddelere uygulanır.

Titrasyon sonucu elde edilen değer 0,054 (ampirik faktör) ile çarpılarak, noniyonik yüzey aktif madde derişimi, standard referans madde olarak alınan 10 mol etilen oksitli nonilfenol (NP 10) cinsinden ifade edilir.

3.2. Reaktifler, cihaz ve malzemeler

Reaktiflerin hazırlanmasında sadece deiyonize su kullanılmalıdır.

3.2.1. Etil asetat, saf, yeni damıtılmış.

3.2.2. Sodyum bikarbonat (NaHCO₃), analitik saflıkta

3.2.3. Hidroklorik asit çözeltisi

Bu çözelti, 20 mL derişik hidroklorik asit 1000 mL su içerisinde çözülerek hazırlanır.

3.2.4. Metanol, analitik saflıkta, yeni damıtılmış, cam şişede muhafaza edilen.

3.2.5. Bromkrezol moru

0.1 g bromkrezol 100 mL metanol içerisinde çözülerek hazırlanır.

3.2.6. Çöktürme reaktifi

Çöktürme reaktifi, iki kısım A çözeltisi ile bir kısım B çözeltisinin karıştırılması ile hazırlanır. Karışım, kahverengi bir şişede muhafaza edilmeli ve karıştırıldıktan sonra bir hafta içinde kullanılmalıdır.

3.2.6.1. A çözeltisi

Analitik saflıkta 1.7 g bizmut nitrat (BiONO₃.H₂O), 20 mL buzlu asetik asitte çözülür ve su ile 100 mL’ye tamamlanır. Ayrı bir kapta, analitik saflıkta 65 g potasyum iyodür 200 mL suda çözülür. Bu iki çözelti 1000 mL’lik ölçülü bir balonda karıştırılır, üzerine 200 mL buzlu asetik asit ilâve edilir ve su ile 1000 mL’ye tamamlanır.

3.2.6.2. B çözeltisi

Analitik saflıkta 290 g baryum klorür (BaCl₂.2 H₂O) 1000 mL suda çözülür.

3.2.7. Buzlu asetik asit, % (99-100)’lük (daha düşük derişimler arzu edilmez).

3.2.8. Amonyum tartarat çözeltisi

Analitik saflıkta 12.4 g tartarik asit ile analitik saflıkta 12,4 mL amonyak çözeltisi (d=0,910 g/mL) karıştırılır ve su ile 1000 mL’ye tamamlanır (Bu amaçla, eşdeğer miktarda analitik saflıkta amonyum tartarat ta kullanılabilir).

3.2.9. Amonyak çözeltisi, seyreltik.

Analitik saflıkta 40 mL derişik amonyak çözeltisi (d=0,910 g/mL) su ile 1000 mL’ye tamamlanır.

3.2.10. Standard asetat tampon çözeltisi

Analitik saflıkta 40 g katı sodyum hidroksit bir beherde 500 mL su ile çözülür ve soğutulur. Çözeltiye 120 mL buzlu asetik asit (Madde 3.2.7) ilâve edilir, iyice karıştırılır, soğutulur, 1000 mL’lik ölçülü balona aktarılır ve işaret çizgisine kadar su ile tamamlanır.

3.2.11. Pirolidinditiyokarbamat çözeltisi (karbat çözeltisi),

103 mg pirolidinditiyokarbamat (C₅H₈NNaS₂.2H₂O) yaklaşık 500 mL suda çözülür, analitik saflıkta 10 mL n-amil alkol ve analitik saflıkta 0.5 g sodyum bikarbonat (NaHCO₃) ilâve edilir ve su ile 1000 mL’ye tamamlanır.

3.2.12. Bakır sülfat çözeltisi

Stok çözelti:

Analitik saflıkta 1.249 g bakır sülfat (CuSO₄.5H₂O) 50 mL 0,5 M sülfürik asit çözeltisi ile karıştırılır ve su ile 1000 mL’ye tamamlanır.

Standard çözelti:

50 mL stok çözelti, 10 mL 0.5 M sülfürik asit (H₂SO₄) ile karıştırılır ve su ile 1000 mL’ye tamamlanır.

3.2.13. Sodyum klorür, analitik saflıkta.

3.2.14. Gaz ayırma cihazı (Bkz. Şekil 5)

Sinterlenmiş diskin çapı, silindirin iç çapı ile aynı büyüklükte olmalıdır.

3.2.15. Ayırma hunisi, 250 mL’lik.

3.2.16. Manyetik karıştırıcı, (25-30) mm’lik bir magneti bulunan.

3.2.17. Gooch krozesi, Tip G 4, delikli tabanının çapı 25 mm olan.

3.2.18. Cam elyaf süzgeç kağıtlar, daire şeklinde, daire çapı 27 mm ve lif çapı (0.5-1.5) μm olan.

3.2.19. Süzme (Nuçe) erlenleri, iki adet, 250 mL ve 500 mL’lik, adaptörlü ve lastik tapalı.

3.2.20. Potansiyometre, kaydedicili, ölçme aralığı 250 mV olan, parlak plâtin indikatör elektrodu ve kalomel veya gümüş/gümüş klorür referans elektrodu bulunan, (20-25) mm kapasiteli bir otomatik büreti veya alternatif olarak manuel donanımı bulunan.

3.3. İşlem

3.3.1 Yüzey aktif maddelerin deriştirilmesi ve ayrılması

Sulu numune bir kalitatif süzgeç kâğıdından süzülür. Süzüntünün ilk 100 mL’lik kısmı atılır. Önceden etil asetat ile çalkalanmış ayırma cihazı içine, (250-800) μm noniyonik yüzey aktif madde bulunduracak miktarda numune konur. Ayrılmayı kolaylaştırmak için 100 g sodyum klorür ve 5 g sodyum bikarbonat ilave edilir. Numune hacmi 500 mL’den fazla ise, bu tuzlar ayırma cihazına katı halde konur ve azot veya hava geçirilerek çözülür. Daha küçük hacimli bir numune kullanılmış ise, tuzlar önce 400 mL suda çözülür ve daha sonra ayırma cihazına ilave edilir. Cihaza, önce üst musluk seviyesine kadar su ve daha sonra suyun üzerine dikkatlice 100 mL etil asetat ilave edilir.           

Gaz (azot veya hava) hattındaki yıkama şişesine 2/3’üne kadar etil asetat konur. Cihazdan (30-60) L/h akış hızı altında gaz geçirilir. Akış ölçmelerinde bir rotametre kullanılması tavsiye edilir. Havalandırma hızı başlangıçta yavaş yavaş arttırılır. Daha sonra gaz akışı, faz ayırımının belirgin bir şekilde görüleceği ve fazların birbirleriyle karışmasının ve sudaki etil asetat çözeltisinin en az olacağı biçimde ayarlanır. 5 dakika sonra gaz akışı durdurulur. Organik fazın hacminde sudaki çözeltisi sebebiyle % 20’den fazla bir azalma olur ise, gaz akışı dikkatlice ayarlanarak ayırma işlemi tekrarlanır.

Organik faz ayırma hunisine alınır. Ayırma hunisinde bulunabilecek bir kaç mL su, gaz ayırma cihazına geri alınır. Etil asetat fazı kuru, kalitatif süzgeç kağıdından 250 mL’lik behere süzülür.

Gaz ayırma cihazına 100 mL daha etil asetat konur ve 5 dakika müddetle tekrar azot veya hava geçirilir. Organik faz ilk ayırmada kullanılan ayırma hunisine alınır, sulu faz atılır ve organik faz, ilk etil asetat kısmının süzüldüğü süzgeçten süzülür. Ayırma hunisi ve süzgeç 20 mL etil asetat ile yıkanır.

Etil asetat ekstraktı bir su banyosunda (çeker ocak içinde) kuruluğa kadar buharlaştırılır. Buharlaştırmayı arttırmak için, çözeltinin yüzeyi üzerinden hafif bir hava akımı geçirilir.

3.3.2. Çöktürme ve süzme

Madde 3.3.1’de elde edilen kuru kalıntı 5 mL etanolde çözülür, 40 mL su ve 0.5 mL seyreltik hidroklorik asit (Madde 3.2.3) ilave edilir ve manyetik karıştırıcıda karıştırılır. Bu çözeltiye ölçme silindirinden 30 mL çöktürme reaktifi (Madde 3.2.6) ilave edilir. Çözelti sürekli karıştırılarak çökelti oluşturulur. 10 dakikalık bir karıştırma işleminden sonra çözelti en az 5 dakika müddetle kendi halinde bekletilir. Karışım tabanı cam elyaf süzgeç kağıdı ile kaplanmış bir Gooch krozesinden süzülür. Süzgeç kâğıdındaki kalıntı, vakum uygulanarak 2 mL buzlu asetik asit ile yıkanır. Çökeltiden hazırlanacak çözelti titrasyon için aynı behere alınacağından, beher çeperlerine yapışmış çökeltinin kantitatif olarak (tamamıyla) alınması önemli değildir.

3.3.3. Çökeltiden çözelti hazırlanması

Süzgeç krozesindeki çökeltiye  10’ar mL’lik kısımlar halinde üç sefer yaklaşık 80 ⁰C (353 K) sıcaklıkta amonyum tartarat çözeltisi (Madde 3.2.8) ilâve edilir ve çökelti çözülür. Her 10 mL’lik tartarat çözeltisi ilâvesinden sonra, emme uygulanmaksızın bir iki dakika beklenir. Süzme erlenindeki süzüntü çöktürme işleminin yapıldığı behere alınır. Kalan çökeltinin  çözünmesi için beherin çeperleri 20 mL tartarat çözeltisi ile yıkanır. Kroze, adaptör ve süzme erleni (150-200) mL su ile yıkanır, yıkama suları behere ilâve edilir.

3.3.4. Titrasyon

Çözelti, manyetik karıştırıcı (Madde 3.2.16) ile karıştırılır, bir kaç damla bromkrezol moru (Madde 3.2.5) ve renk menekşeye dönüşünceye kadar seyreltik amonyak çözeltisi (Madde 3.2.9) ilâve edilir (Çözelti, asitle yıkanma sebebiyle hafifçe asidiktir). Çözeltiye daha sonra 10 mL standard asetat tampon çözeltisi (Madde 3.2.10) ilâve edilir, elektrotlar daldırılır ve büret ucu çözeltiye daldırılmış olarak standard karbat çözeltisi (Madde 3.2.11) ile potansiyometrik olarak titre edilir. Titrasyon hızı 2 mL/min ‘i geçmemelidir.

Dönüm noktası, titrasyon eğrisinin iki kanadının kesiştiği noktadır. Zaman zaman, titrasyon eğrisinin dönüm yerinde düzleşme görülebilir. Bu durum, plâtin elektrodun dikkatlice temizlenmesi ile (zımpara kağıdı kullanılarak) önlenebilir.

3.3.5. Şahit deneyler

Aynı zamanda, numune kullanılmaksızın, Madde 3.3.2’de belirtilen işlemlere uygun olarak,  5 mL metanol ve 40 mL su kullanılarak yukarıda belirtilen işlemlerin tamamı uygulanarak bir şahit deney yapılır.

Titrasyonda harcanan standard karbat çözeltisi miktarı 1 mL’yi aşmamalıdır. Aşıyorsa, kullanılan reaktiflerin (Madde 3.2.3, Madde 3.2.7, Madde 3.2.8, Madde 3.2.9, Madde 3.2.10), özellikle ağır metal muhtevası açısından, saflığından şüphe duyulur. Bu durumda, reaktifler değiştirilmelidir. Şahit deney sonucu, nihai sonuçların hesaplanmasında (Madde 3.4) göz önüne alınmalıdır.

3.3.6. Karbat çözeltisi faktörünün kontrolü

Karbat çözeltisi için faktör tayini, çözeltinin kullanılacağı gün yapılmalıdır. Bu amaçla, 10 mL bakır sülfat çözeltisi (Madde 3.2.12), 100 mL su ve 10 mL standard asetat tampon çözeltisi (Madde 3.2.10) ilavesinden sonra karbat çözeltisi ile titre edilir. Faktör (f), aşağıdaki gibi hesaplanır:

f =

Burada;

a: Titrasyonda harcanan mL cinsinden karbat çözeltisi miktarıdır.

Bütün titrasyon sonuçları bu faktörle çarpılmalıdır.

3.4 .Sonuçların hesaplanması

Her noniyonik yüzey aktif maddenin, bileşimine ve özellikle de alken oksit zincirinin uzunluğuna bağlı olarak farklı bir faktör değeri vardır. Noniyonik yüzey aktif madde derişimi, standard madde olarak kabul edilen 10 etilen oksit birimli bir nonilfenol (NP 10) cinsinden ifade edilir. Nonilfenol için dönüşüm faktörü 0.054’tür.

Bu faktör kullanılarak, noniyonik aktif madde miktarı, mg NP 10 eşdeğeri olarak, aşağıdaki formülle verilir:

Noniyonik yüzey aktif madde miktarı (mg NP 10 olarak) = (b – c) x f x 0.054

Burada;

b = Numune için harcanan karbat çözeltisi hacmi, mL,

c = Şahit deneyde harcanan karbat çözeltisi hacmi, mL,

f  = Karbat çözeltisinin faktörü

dür.

3.5 Sonuçların gösterilmesi

Tayin sonucu 0.1 mg/L NP 10 yaklaşımla, mg/L NP 10 cinsinden verilir.